1.3實驗方法

1.3.1 LOPs的制備

新鮮牡蠣開殼后取出全肉，牡蠣肉與水按照料液比為1∶3(g:mL)進行勻漿處理，8 000 r/min勻漿2 min，按3 300 U/g加入動物蛋白酶，47℃下酶解3 h，酶解后于95℃滅酶10 min，于4 500 r/min離心20 min，收集上清液。用超濾膜過濾上清液，將濾液濃縮處理后進行噴霧干燥，即可獲得LOPs。

1.3.2 LOPs界面性質(zhì)檢測

1.3.2.1 LOPs濕潤性測定

采用全自動界面黏彈性測量儀測定LOPs的三相接觸角θ，將LOPs薄片(厚度為1 mm、直徑為10 mm)置于載物臺后(環(huán)境為氣相)，向下緩慢移動針管(懸掛8μL的液滴)使得液滴(液相)轉(zhuǎn)移至薄片(固相)，利用系統(tǒng)攝像機拍攝記錄圖像。在每個片劑表面的不同位置進行測量，測量結(jié)果取平均值。

1.3.2.2 LOPs水溶液界面張力測定

池內(nèi)，形成18μL的LOPs液滴浸沒于大豆油中，懸掛時間為600 s。在室溫(25℃)下，使用儀器自帶軟件分析液滴輪廓，并監(jiān)測液滴形狀的動態(tài)變化，根據(jù)楊氏方程(Laplace-Young)擬合結(jié)果計算液滴的界面張力。

1.3.3 LOPs雙重乳液制備及體外模擬消化吸收特性測定

1.3.3.1 LOPs的W1/O/W2型雙重乳液制備

通過兩步法制備雙重乳液，制備流程及分子模型見圖1。操作步驟:將內(nèi)、外水相及油相攪拌15 min，混勻后于4℃避光貯藏12 h備用;第一步，將質(zhì)量分數(shù)為20%的LOPs水溶液作內(nèi)水相，內(nèi)水相與油相的質(zhì)量比為4∶6。將內(nèi)水相加入含有PGPR(質(zhì)量分數(shù)為5%)的大豆油中，先經(jīng)高速剪切機(12 000 r/min，2 min)混合后，再經(jīng)高壓均質(zhì)機在70 MPa條件下循環(huán)3次，獲得W1/O初乳液。第二步，將質(zhì)量分數(shù)為0.8%的吐溫80水溶液作外水相，W1/O乳液與外水相的質(zhì)量比為5∶5。將W1/O乳液加入外水相后，再用高速剪切機(4 000 r/min，1 min)混合，并經(jīng)高壓均質(zhì)機在30 MPa的條件下均質(zhì)1次，獲得LOPs的W1/O/W2型雙重乳液，于4℃條件下存儲。

圖1 LOPs雙重乳液制備流程及其分子模型

1.3.3.2體外模擬消化液的配制與消化實驗

模擬消化液是由相應的電解質(zhì)溶液、酶、CaCl2和膽酸鹽組成。按表1配制各階段的模擬消化液，其中，采用NaOH、HCl調(diào)節(jié)模擬消化液的pH值(模擬唾液的pH值為7、模擬胃液的pH值為3和模擬腸液的pH值為7)，CaCl2(H2O)2可在酸環(huán)境下形成CaCl2。將模擬消化液與新鮮乳液、上一階段消化后的乳液以體積比1∶1混合，于37℃，120 r/min的條件下進行模擬消化，模擬口腔消化時長5 min，模擬胃消化和腸道消化時長均為2 h。取各階段消化產(chǎn)物與新鮮未消化乳液用于分析測定，比較模擬消化前后乳液的粒徑、包封率與顯微結(jié)構的變化情況。

表1模擬消化液的配制

括號中帶*數(shù)字為最終消化混合物中相應的Ca2+濃度。

1.3.3.3粒徑測定

采用馬爾文納米粒度儀，室溫條件下測定乳液粒徑，于折射率為1.33，光散射角度為173°條件下，測定乳液的平均粒徑、多分散指數(shù)(polydispersity index，PDI)和粒徑分布。

1.3.3.4光學顯微鏡觀察

取樣品約5μL滴加于載玻片上，使用光學顯微鏡于100倍油鏡物鏡視野下進行觀察，利用系統(tǒng)攝像機記錄微觀形態(tài)照片。

1.3.3.5包封率測定

取6 g待測樣品與去離子水以質(zhì)量比1∶1稀釋，輕輕手搖混勻，然后在3 000 r/min、4℃條件下離心10 min。利用注射器針頭收集每個離心樣品的水層(乳液的下層)，并使用0.22μm注射器式過濾器過濾油滴后取得濾液。采用BCA蛋白質(zhì)試劑盒制作LOPs的標準曲線，測定濾液中LOPs的含量，標準曲線方程為:y=0.014 2x+0.166 2(R2=0.979)。包封率(EE)計算公式見式(1)。

(1)

式(1)中，EE為包封率，%;m0為LOPs加入內(nèi)水相的質(zhì)量，g;m為從外水相中獲得的游離LOPs的質(zhì)量，g。

1.3.4 LOPs及其雙重乳液的體外模擬吸收與轉(zhuǎn)運實驗

1.3.4.1 LOPs及其雙重乳液對Caco-2細胞的毒性實驗

選取生長對數(shù)期的Caco-2細胞，將其接種在96孔酶標板(1×105個/孔)并置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(含體積分數(shù)為5%的CO2、溫度設為37℃)約24 h后，加入100μL不同濃度(基礎培養(yǎng)基稀釋)的LOPs水溶液及其雙重乳液(稀釋前沸水浴加熱30 min滅菌，乳液未破乳)，每個濃度設置6個平行，于含有體積分數(shù)為5%的CO2、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向每孔加入體積為20μL的MTT溶液(5 mg/mL)和80μL基礎培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育4 h后，除去孔內(nèi)培養(yǎng)液并向每孔加入150μL的DMSO，將培養(yǎng)板置于搖床上低速振蕩10 min。用酶標儀測定酶標板各孔在490 nm的吸光度。實驗中同時設立正常細胞對照孔(無樣品，有Caco-2細胞、培養(yǎng)液、MTT和DMSO)以及空白對照孔(無樣品，無Caco-2細胞，有培養(yǎng)基、MTT和DMSO)。根據(jù)測定的吸光度計算Caco-2細胞的存活率，計算方法見式(2)。

式(2)中，A為樣品吸光度，A0為空白對照組吸光度，A1為正常細胞培養(yǎng)的對照組吸光度。

1.3.4.2 Caco-2單層細胞模型的建立與驗證

構建3個初始細胞密度分別3×105、5×105、10×105個/mL的Caco-2單層細胞模型，用Transwell培養(yǎng)皿接種Caco-2細胞，細胞接種模型見圖2。細胞生長狀態(tài)維持21 d左右，前7 d每兩天更換膜兩側(cè)培養(yǎng)基，后14 d每天定時更換膜兩側(cè)培養(yǎng)基，直到Caco-2細胞完全融合形成完整的單層。通過測定跨膜電阻、堿性磷酸酶(AKP)活性和熒光素鈉通量比較和驗證單層Caco-2細胞模型的完整性、分化狀況和致密性。

圖2 Caco-2細胞接種的Transwell培養(yǎng)皿模型

1)跨膜電阻的測定。采用電阻儀測定并記錄細胞膜兩側(cè)的跨膜電阻(trans-epithelial electrical resis-tance，TEER)，根據(jù)式(3)計算TEER。

TEER=(R-R0)×S。(3)

式(3)中，TEER為跨膜電阻，Ω·cm2;R為頂膜側(cè)(AP)的電阻，Ω;R0為基底膜側(cè)(BL)的電阻，Ω;S為膜面積(1.12 cm2)。

2)AKP活性測定。采用AKP試劑盒分別測定AP側(cè)、BL側(cè)的堿性磷酸酶活性，酶活性單位為金氏單位/100 mL(一個金氏單位=7.14 U/L)，并計算膜兩側(cè)的酶活力比值(AP/BL)。

3)熒光素鈉通量測定。制作490 nm處熒光素鈉的標準吸收曲線;采用培養(yǎng)21 d后的Transwell培養(yǎng)皿，于AP側(cè)加入0.5 mL、20μg/mL熒光素鈉溶液(D-hanks平衡液溶解)，BL側(cè)加入1.5 mL的D-hanks平衡液，每間隔30 min測定BL側(cè)在490 nm處的吸收度，并補充BL側(cè)平衡液體積至1.5 mL，共計培養(yǎng)2 h。根據(jù)式(4)計算熒光素鈉透過率。

式(4)中，mBL側(cè)為BL側(cè)的熒光素鈉質(zhì)量，μg;mAP側(cè)初始為10μg。

1.3.4.3 Caco-2單層細胞轉(zhuǎn)運實驗

根據(jù)1.3.3.2中的實驗結(jié)果，選取合格的細胞模型，測定LOPs溶液、LOPs雙重乳液(依據(jù)毒性實驗結(jié)果選取)在膜兩側(cè)的表觀滲透系數(shù)和流出比(表觀滲透系數(shù)比值)，探究兩者的運輸方式。運輸實驗在兩個方向上進行。AP側(cè)→BL側(cè):AP側(cè)加入0.5 mL樣品液，BL側(cè)加入1.5 mL D-hanks的平衡液。BL側(cè)→AP側(cè):在BL側(cè)加入1.5 mL樣品液，AP側(cè)加入0.5 mL D-hanks平衡液。分別孵育150 min后收集BL側(cè)、AP側(cè)溶液待測。采用BCA蛋白測定法測定待測液中LOPs含量。根據(jù)樣品在兩個方向上的檢測結(jié)果計算表觀滲透系數(shù)Papp(AP-BL)、Papp(BL-AP)及兩個方向上的表觀滲透系數(shù)比值Papp(BL-AP)/Papp(AP-BL)，計算方法見式(5)。

式(5)中，Q為AP側(cè)或BL側(cè)檢測到的轉(zhuǎn)運量;t為實驗轉(zhuǎn)運時間(150 min);S為膜面積(1.12 cm2);c0為BL側(cè)或AP側(cè)樣品的初始濃度。

1.4數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，用OrginPro2024軟件繪圖。用SPSS 26.0軟件采用方差分析進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。